Анализатор BactoSCREEN на базе масс-спектрометра MALDI-TOF для идентификации микроорганизмов и изучения их чувствительности к антибиотикам
На базе времяпролетного масс-спектрометра LaserToF LT2 Plus НПФ «Литех» создана первая отечественная система масс-спектрометрической идентификации микроорганизмов и изучения их чувствительности к антибиотикам – микробиологический анализатор BactoSCREEN. В основе системы идентификации используется алгоритм, позволяющий быстро и точно производить идентификацию микроорганизмов по их белковому спектру. Идентификация в BactoSCREEN происходит по рибосомальным белкам, которые являются уникальными для любых микроорганизмов. Биоинформационное программное обеспечение позволяет надёжно и точно проводить видовую идентификацию микроорганизмов путём сопоставления получаемых масс-спектров бактерий с базой данных BactoSCREEN, которая содержит сведения о более, чем 2300 видах микроорганизмов всех типов: бактерий, микобактерий, мицелиальных и дрожжевых грибов.
BactoSCREEN ( настольные микробиологические анализаторы) представляют собой автоматизированные многоцелевые измерительные системы, состоящие из лазера, ионного источника, вакуумной камеры, анализатора масс и управляющего компьютера. Ионизация производится лазерным излучением, взаимодействующим с пробами, на которые предварительно наносится матрица (метод MALDI). Возможность программируемого сканирования проб обеспечивает высокую производительность анализов (до 96 за одну загрузку системы). Детектирование ионов осуществляется в вертикально расположенном времяпролетном анализаторе в линейном режиме.
Кроме того, в системе BactoSCREEN используется дополнительный механизм подтверждения идентификации по белковым масс-спектрам с использованием данных геномных последовательностей, имеющихся в таких мировых публичных репозитариях, как GenBank, PATRIC. При этом масс-спектры, полученные в ходе работы на приборе, сравниваются уже не со спектрами из базы данных BactoSCREEN, а с белковыми спектрами, которые по специальному алгоритму реконструируются на основе имеющейся в репозитории геномной последовательности идентифицированного микроорганизма.ПО BactoSCREEN позволяет производить кластерный и корреляционный анализ, что дает возможность проводить субтипирование микроорганизмов. В ПО BactoSCREEN имеются специальные разделы для выполнения исследований чувствительности к антибиотикам по гибели бактериальных клеток. Кроме того, существует и возможность по выявлению резистентных штаммов на базе технологии обнаружения специфических продуктов биодеградации антибиотиков (выявление бета-лактамазной и карбопенемазной активности)
В системе BactoSCREEN высокое качество результатов сочетается с простотой в эксплуатации и обслуживании: ∙ Несложная пробоподготовка: менее 1 минуты на образец. Анализируемый материал: колонии микроорганизмов, содержимое флаконов для гемокультуры, моча, кал. ∙ Аппаратная часть системы реализована в виде компактного настольного прибора. Отсутствуют сложные настройки и калибровки. ∙ После помещения многоразовой стальной плашки с образцами в прибор первые результаты идентификации микроорганизмов начинают поступать через 1-2 минуты. Высокая точность и воспроизводимость результатов, характерные для масс-спектрометрии. ∙ Результаты определения чувствительности к антибиотикам по гибели бактериальных клеток готовы примерно через 3 часа после засева с использованием специального набора реагентов.
НАЗНАЧЕНИЕ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Первый отечественный микробиологический анализатор на базе времяпролетного масс-спектрометра MALDI с линейным режимом регистрации ионов предназначен для автоматизированных измерений масс-спектров веществ и материалов. Кроме решения научных задач в таких областях, как биохимия, биотехнология, фармацевтика, масс-спектрометры класса MALDI в настоящее время широко используются для решения прикладных задач в клинической и ветеринарной микробиологии и фитопатологии, где применяются для идентификации микроорганизмов на основании изучения их белковых спектров. Анализатор, в частности, зарегистрирован в качестве медицинского изделия.
Открытый микробиологический анализатор BactoSCREEN является функциональным аналогом известной системы MALDI Biotyper производства компании Bruker Daltonics, США.
Описание методики
1. Единичная колония первичного посева
2. Наносится на мишень прибора
3. На образец наслаивается 1 мкл раствора матрицы (α-циано-4-гидроксикоричная кислота)
4. Мишень помещается в прибор
5. ПО обеспечивает:
снятие спектра;
обработку полученного спектра;
сравнение спектра неизвестного микроорганизма со спектрами из базы данных;
идентификацию микроорганизма.
В основе идентификации микроорганизмов с помощью системы MALDI BactoSCREEN лежит получение спектра константных белков неизвестного микроорганизма с помощью MALDI TOF масс-спектрометра и последующее сравнение полученного спектра с базой данных.
Процедура пробоподготовки состоит в перенесении единичной колонии микроорганизмов на мишень прибора и наслоении раствора матрицы (α-циано–4-гидроксикоричная кислота) поверх анализируемого образца. Мишень прибора с нанесенными образцами помещается в масс-спектромет. С образца снимается суммарный спектр, состоящий из 240 единичных спектров. Суммарный спектр преобразуется в «основной спектр» (набор пиков разных масс), который сравнивается со спектрами базы данных. При сравнении для каждого спектра из базы данных высчитывается коэффициент совпадения со спектром неизвестного микроорганизма. Микроорганизм, чей масс-спектр имеет наибольшее значение данного коэффициента, вносится в таблицу результатов. При этом достоверными считаются результаты, для которых значение коэффициента совпадения выше определенной величины.
Инструкция
Идентификация микроорганизмов на микробиологическом анализаторе BactoSCREEN (Россия)
Поскольку вакуум в анализаторе набирается в течение 24 часов после включения, прибор остаётся включённым постоянно.
На передней панели инструмента есть единственная кнопка с подсветкой для загрузки и смены плашек и 4 светодиодных лампы (рис.1).
Светящиеся светодиодные лампы справа обозначают (снизу-вверх):
включенное электропитание,
достаточный для работы вакуум,
высокое напряжение и процесс снятия спектров
получения результатов.
Загрузка образцов.
Нажмите кнопку загрузки.
Когда она загорится постоянным зелёным светом (рис.2),
можно открыть круглую крышку и поставить
или сменить плашку с образцами (рис.3) в загрузочной камере.
Благодаря одному закруглённому углу плашку можно установить только в единственном положении: закруглённый угол плашки будет ближайшим правым к оператору (Рис.4).
Закройте крышку. Когда мишень будет загружена и крышка закрыта, нажмите кнопку загрузки ещё раз. С установлением достаточного вакуума свет у кнопки станет мигающим голубым. Постоянный голубой свет кнопки будет означать, что мишень уже находится в зоне анализа.
Управление прибором возможно как с клавиатуры, так и с сенсорного экрана.
Для проведения анализа используется программа BactoSCREEN – ID (автоматическая идентификация).
Откройте программу BactoSCREEN-ID, кликнув на иконку на экране монитора.
На панели основных команд BactoSCREEN-ID возможно ввести новую плашку-мишень, нажав кнопку
или выбрать файл интересующей постановки из архива.
Заполнение плашки.
В строке “ИН мишени” (Идентификационный номер плашки/ мишени), введите название, под которым будет сохранён файл с результатами. Удобно в названии указать и дату постановки (Рис.5). Возможно ввести как буквенное, так и числовое обозначение. Если этого не сделать, то программа автоматически выведет дату и время постановки.
Вид схемы плашки/мишени для заполнения. Рамкой красного цвета обозначено поле для введения идентификационного номера.
Для визуального удобства ячейки будут иметь разный фон:
Нажатие левой клавишей мыши на ячейку плашки выводит табло для заполнения (рис.6).
Если на одной из ячеек вы ставите бактериальный стандарт, то в этом случае надо поставить галочку и отметить ею калибратор. Положение такой ячейки с калибратором выбирается пользователем. Поле этой ячейки окрасится в жёлтый цвет. Ячейки с номерами или названиями образцов окрасятся после заполнения голубым цветом.
Заполнив плашку/мишень, нажмите для запуска измерения кнопку
При первичном получении бактериального стандарта или при смене бакстандарта вводят его данные (серию калибратора и годность калибратора) в выпадающее табло после нажатия на панели основных команд кнопки “Настройки приложения” (Рис.7). Эти сведения будут в дальнейшем автоматически распечатываться в отчёте самодиагностики и калибровки микробиологического анализатора BactoSCREEN.
Отображение статуса анализа. В процессе снятия спектров и проведения идентификации программа будет отображать состояние ячеек в режиме просмотра с цветовой индикацией состояния.
Результат снятия спектра появится в левой половине ячейки, результат идентификации микроорганизма – в правой половине ячейки.
Цвет правой половины ячейки свидетельствует о результате идентификации по степени сходства с референсными спектрами в базе данных:
Результаты анализа.
После окончания анализа на экране появляется сообщение ”Анализ выполнен”.
Результаты анализа автоматически будут сохранены в архиве.
Пример результата анализа в виде состояния ячеек на плашке-мишени представлен на рис.8.
Рис. 8. Результаты анализа полученных спектров и идентификации микроорганизмов при сравнении спектров образцов с референсными.
Нажатие кнопки “Подробно о ячейках” представляет развёрнутый результат идентификации.
Развёрнутый результат идентификации (Рис. 9).
Поле экрана с результатами разделено на 3 части. В левой части отображается список проанализированных ячеек.
При нажатии левой клавишей мыши на выбранную ячейку в центральной части поля появится изображение полученного белкового спектра исследуемого микроорганизма.
А в правой части поля приведён результат идентификации.
Сверху расположен результат с наибольшей достоверностью и название идентифицированного микроорганизма.
Полученные результаты отсортированы по мере убывания достоверности.
Зелёный цвет кружка рядом с названием свидетельствует о достоверной идентификации до вида.
Если нажать левой кнопкой мыши в правом поле на название микроорганизма, то в центральной графической части будет представлено сравнение обработанного экспериментального белкового спектра (сверху) с референсным спектром базы данных (снизу) (Рис. 10).
Зелёным цветом анализируемого спектра выделены пики, совпадающие с базой.
Желтым – пики, не совпадающие с базой по ряду параметров.
Красным – пики, отсутствующие в базе данных.
Отчёты.
Нажатие на панели основных команд кнопки “Отчёт идентификации” выведет на экран соответствующий отчёт (Рис.11).
При наличии принтера его можно распечатать.
Верхняя часть отчёта содержит перечень ячеек с названиями/номерами образцов и названия микроорганизмов, определённых в этих образцах с максимальными числовыми значениями достоверности идентификации. Если спектр получить не удалось, по такой ячейке в отчёте будет сообщение “спектр отсутствует”. В нижней части отчёта приведены более детальные результаты анализа по каждой из ячеек.
Отчёт самодиагностики и калибровки микробиологического анализатора BactoSCREEN можно при необходимости вывести на экран, нажав сначала на панели основных команд кнопку “О программе”, а затем на выпадающем экране нажать кнопку “QC Отчёт”.
Работа с архивом.
Все ранее отснятые эксперименты могут быть доступны для просмотра, для чего необходимо нажать кнопку “Архив” на панели основных команд.
На экране появится табло со списком сохранённых файлов (рис.13).
Выбрав интересующий файл, его можно открыть, нажав на находящуюся напротив кнопку.
Убрать список следует нажатием кнопки “Завершить”в правом верхнем углу окна.
Далее можно работать с выбранным и открытым файлом.
Широта применения методики
Спектр идентифицируемых микроорганизмов
Система позволяет идентифицировать: мицелиальные грибы, дрожжи, Грам (+) и Грам (-) бактерии.
Типы анализируемых образцов
Идентификация микроорганизмов, после культивации на питательных средах
В случае если вы проводите идентификацию микроорганизмов после предварительной культивации на питательных средах, возможно использование любого типа среды – это не окажет никакого влияния на получаемый результат
Прямая идентификация микроорганизмов из биологических образцов. Моча
При использовании системы BactoSCREEN для идентификации микроорганизмов существует возможность прямой идентификации возбудителя из мочи. В этом случае, процедура пробоподготовки состоит в получении осадка из образца мочи и проведении полученного осадка через процедуру экстракции муравьиной кислотой/этанолом.
Гемокультура
Система MALDI Bactoscreen позволяет проводить прямую идентификацию микроорганизма из положительной гемокультуры. Процедура пробоподготовки при этом состоит из последовательных центрифугирований образца и занимает не более 20 (!!!) минут.
Пробоподготовка образцов гемокультуры для анализа. Бактерии находятся в слое над гелем
Методика:
2-4 мл положительной культуры центрифугировать (10 мин)
Слой над гелем (см.рис) ресуспендировать в 1 мл dd H2O
Центрифугировать с низкой скоростью (3 мин)
Перенести супернатант в новую пробирку Eppendorf.
Центрифугировать с высокой скоростью (3 мин).
Примечание: При работе с геманализатором BacT/ALERT (bioMérieux, Франция) используются флаконы с углем. Для прямой идентификации из положительной культуры в данном случае дополнительно используется фильтр (рекомендуется фильтр Sigma Prep Spin Column, SC1000-1KT)
Расходные материалы
«MALDI-TOF проба» набор реактивов для профилирования микроорганизмов
Набор рассчитан на анализ 1000 микроорганизмов, как методом прямого нанесения, так и методом белковой экстракции.
Кат.№: МТ-163
Набор включает в себя все реагенты необходимые для идентификации микроорганизмов методом MALDI – TOF масс-спектрометрии:
1. Единичная колония первичного посева
2. Наносится на мишень прибора
3. На образец наслаивается 1 мкл раствора матрицы (α-циано-4-гидроксикоричная кислота)
4. Мишень помещается в прибор
